ИЗУЧЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НОВОГО СЕРЕБРОСОДЕРЖАЩЕГО ПОРИСТОГО КОМПЛЕКСА

Ключевые слова: сорбент, серебро, сальмонелла, пищевые отравления.

Введение. Развитие современного фармацевтического рынка в последнее время привлекает всеобщее внимание. Однако, несмотря на высокий уровень развития современной медицины и фармацевтической отрасли, решение проблемы кишечных инфекций остается актуальной. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно в мире погибает до 5 млн детей от кишечных инфекций различной этиологии. В подтверждение этих данных анализ компании ЗАО «Группа ДСМ» (компания, проводящая мониторинг фармацевтического рынка РФ, а также мониторинг мирового фармацевтического рынка, www.dsm.ru) — за первое полугодие 2015 года в рейтинге натуральных объемов продаж одну из лидирующих позиций занимают препараты из АТС-группы [A] «Пищеварительный тракт и обмен веществ», общая доля которых — 27,4 %, кроме того, этой же группе принадлежит максимальный прирост, который в 2015 году составил +28,7 %. Первое место по натуральному показателю среди подгрупп в группе [A] занимают противодиарейные препараты [A07]. Эти данные свидетельствуют, что проблема профилактики и лечения кишечных инфекций является, кроме всего, и экономически значимой. Имеется потребность в новых более эффективных и недорогих препаратах.

Из существующих и широко используемых зарегистрированных препаратов для профилактики и лечения кишечных инфекций выделяют две основные большие группы: кишечные противомикробные и противовоспалительные препараты (А07А) — антибактериальные препараты (А07 АА), сульфаниламиды (A07AB), производные имидазола (А07АС), прочие кишечные противомикробные препараты (07АХ) и кишечные адсорбенты (А07В) — это препараты угля (A07BA), висмута субгалат (A07BB), прочие кишечные адсорбенты (A07BC). Интерес вызывает более детальное рассмотрение второй группы препаратов.

Группа адсорбенты (или энтеросорбенты) — это препараты с многовековой историей [1], которая долгое время находилась в некотором забвении, поскольку основное фармакологическое действие изучено в самом широком смысле этого слова. Главным недостатком «чистых» сорбентов в проблеме лечения кишечных инфекций является отсутствие специфической антимикробной и противовирусной активности, поскольку, задерживаясь в порах матрицы, микроорганизмы не погибают, а при наличии питательной среды активно размножаются. Эти суждения приводят к заключению о необходимости создания комплексного препарата, который будет обладать антибактериальной и детоксикационной активностью [2]. В этом плане большой интерес и перспективность представляют препараты-сорбенты, включающие в свой состав кластерное серебро [3], достоинством которого является способность проявлять комплексную антибактериальную, противовирусную и антигрибковую активность.

В ФБГНУ «НИИКЭЛ» более 20 лет развиваются технологии применения сорбентов в клинической медицине, и в рамках развития этого направления в лаборатории лимфорегуляции был разработан пористый компонент, представляющий собой белый порошок из термоактивированного гидроксида алюминия с нанесенным на его поверхность кремнийорганическим полимером — полиметилсилоксаном (ТАГА). В качестве наносимого биологически активного вещества выбран 1%-й серебросодержащий раствор «Арговит-С», разрешенный к использованию внутрь в качестве биологически активной добавки (ФС 42-11-94-78), что позволило создать препарат, сочетающий детоксикационное и антибактериальное действие.

Цель исследования: оценить микробиологическую активность исходного комплекса на основе термоактивированного гидроксида алюминия и полиметилсилоксана (ТАГА) и модифицированного комплекса с серебросодержащим раствором (Ag/ТАГА) в отношении вырабатываемых эндотоксинов и самой микробной флоры (Salmonella enteritidis) после экспозиции 1, 3, 6, 12 часов при внутрибрюшинном введении центрифугата по критерию смертности и изменению массы внутренних органов: селезенка, печень.

Материалы и методы. Для исследования были взяты сорбенты: исходный — ТАГА, представляющий собой термоактивированный гидроксид алюминия с нанесенным на его поверхность полиметилсилоксаном, и в виде его модификации серебросодержащим компонентом (Ag/ТАГА). В качестве компонента серебра использовали «Арговит-С» производства ООО «Вектор-Вита» [4]. Исследуемые образцы разработаны в ФБГНУ «НИИКЭЛ» совместно с ООО «Вектор-Вита». В табл. 1 представлены физико-химические характеристики разработанных образцов.

Таблица 1

Физико-химические характеристики сорбентов

Примечания: ТАГА — термоактиварованный гидроксид алюминия с нанесенным на его поверхность полиметилсилоксаном; Ag/ТАГА — термоактиварованный гидроксид алюминия с нанесенным на его поверхность полиметилсилоксаном, модифицированный серебросодержащим компонентом «Арговит-С»

Исследования выполнены на базе Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока в соответствии с нормативами, указанными в ГФ XIII т. 1 ОФС.1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота» (табл. 2. Микробиологическая чистота субстанций и вспомогательных веществ для производства лекарственных препаратов) [5].

Культуру Salmonella enteritidis инкубировали с мясопептонным бульоном (МПБ) при температуре 37–38 °С в течение 18–24 часов при рН среды 7,2–7,4 (от 5,0 до 8,0). Оценку сорбционного эффекта проводили в соответствии с Патентом № 2298036 [6] и Методическим указаниям по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями (№ 13-7-2/1759 МСХ РФ, 1999) [7]. К 0,2 мл известного титра бактерий (500 КОЕ/мл) добавляли точную навеску исследуемых препаратов (1 г), время экспозиции составляло 1, 3, 6 и 12 часов при слабом (5 об./мин) перемешивании. Оценку эффективности сорбционных свойств композиций проводили по окончанию экспозиционного времени. Взвесь бактериальной флоры и сорбентов (ТАГА, Ag/ТАГА) центрифугировали и вводили внутрибрюшинно (в/б) лабораторным животным (белые беспородные мыши обоих полов). Оценивали смертность особей и изменение массы внутренних органов: селезенка, печень.

Животные, полученные из вивария ФГБУН СФНЦА ИЭВСиДВ СО РАН, перед началом эксперимента проходили карантин в течение 14-ти дней, содержались в стандартных условиях при соблюдении светового режима (день-ночь по 12 часов) при свободном доступе к воде и корму с использованием в качестве подстилки древесных опилок, заранее дезинфицированных в сухожаровой печи при температуре 150–180 °С в течение 15–20 мин. Эксперимент поставлен с участием 80-ти животных обоих полов белых беспородных мышей весом 15–25 г с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества 86/609/ЕС (Страсбург, 1986). Все животные методом случайного отбора были разделены по 5 особей на каждую контрольную точку (время экспозиции сорбента и микробной флоры — 1, 3, 6 и 12 часов) на 4 группы: I — интактный контроль, II — положительный контроль (в/б введение культуральной взвеси с известным титром на МПБ), III — в/б введение центрифугата ТАГА (1 г ТАГА + 0,2 мл культуры Salmonella enteritidis + 1,8 мл МПБ), IV — в/б введение центрифугата Ag/ТАГА (1 г Ag/ТАГА + 0,2 мл культуры Salmonella enteritidis + 1,8 мл МПБ), табл. 2.

Таблица 2

Экспериментальные группы

Примечание: каждая группа содержала 20 животных по 5 особей на каждую контрольную точку

Различия между группами, в связи с их немногочисленностью, оценивали с помощью непараметрических методов анализа по двустороннему критерию Манна-Уитни, критерий значимости различия выборок был p ≤ 0,05. Статистическую оценку полученных данных проводили с использованием программ Excel 2013 и Statistica 8.0.

Результаты и обсуждение. В ходе эксперимента была выявлена положительная динамика сорбционной активности композиций ТАГА и Ag/ТАГА в отношении токсинов Salmonella enteritidis в зависимости от срока их контакта с микроорганизмами в сравнении с группой положительного контроля (табл. 3).

Таблица 3

Результаты исследования зависимости выживаемости белых беспородных мышей от сорбционной активности в отношении токсинов и микроорганизмов культуры Salmonella enteritidis экспериментальных препаратов (ТАГА, Ag/ТАГА) при разных сроках их контакта с микроорганизмами

Примечание: каждая группа содержала 20 животных по 5 особей на каждую контрольную точку

Наиболее выраженный эффект сорбции токсинов Salmonella enteritidis установлен в группе III (в/б введение центрифугата Ag/ТАГА) в сравнении с группой II (в/б введение центрифугата ТАГА), что подтверждается результатами исследования смертности животных, где показано, что через 1 и 3 часа культивирования с препаратом Ag/ТАГА количество павших мышей меньше на 2 особи, чем за аналогичный период с препаратом ТАГА, а после 6-ти и 12-ти часов культивирования отмечена 100 % выживаемость подопытных животных, в то время как за тот же временной период в группе III (ТАГА) смертность составила 20 % животных. Также отмечено изменение массы селезенки и печени, которые характеризуют степень выраженности воспалительного процесса.

В табл. 4 и 5 представлены параметры по массе селезенки и печени животных в зависимости от сорбционной активности различных комплексов сорбентов в отношении токсинов Salmonella enteritidis.

Таблица 4

Результаты исследования влияния сорбционной активности экспериментальных препаратов (ТАГА, Ag/ТАГА) в отношении токсинов и микроорганизмов культуры Salmonella enteritidis на массу селезенки с учетом времени контакта с микроорганизмами

Примечание: * — P < 0,05 Mann-Whitney U Test в сравнении с группой положительного контроля

В группе III (в/б введение центрифугата Ag/ТАГА) установлено снижение массы селезенки в течение всего периода наблюдения относительно показателей группы II (в/б введение центрифугата ТАГА). Получены статистически значимые различия у групп II и III в сравнении с группой I (положительный контроль), что подтверждает высокую детоксикационную способность препаратов, способных снижать нагрузку на лимфоидный орган, отвечающий за очистку крови от инфекций, в том числе бактериального характера. Аналогичные изменения наблюдаются при исследовании массы печени (табл. 5).

Таблица 5

Результаты исследования влияния сорбционной активности экспериментальных препаратов (ТАГА, Ag/ТАГА) в отношении токсинов и микроорганизмов культуры Salmonella enteritidis на массу печени с учетом времени контакта с микроорганизмами

Примечание: * — P < 0,05 Mann-Whitney U Test в сравнении с группой положительного контроля

Межгрупповые статистически значимые различия массы печени с группой положительного контроля (группа II) были отмечены при экспозиции препарата Ag/ТАГА (группа IV) с культурой бактерий Salmonella enteritidis 1, 3, 6 и 12 часов, в то время как группа препарата ТАГА (группа III) имела достоверные различия лишь при экспозици 12 часов, что указывает на положительную активность серебросодержащего комплексного препарата.

Выводы. Наиболее выраженная антибактериальная активность в отношении вырабатываемых эндотоксинов и самой микробной флоры (Salmonella enteritidis) установлена у серебросодержащего сорбента на основе термоактивированного гидроксида алюминия с нанесенным на его поверхность полиметилсилоксаном (Ag/ТАГА — 100 % выживаемость после экспозиции 6 и 12 часов) в сравнении с немодифицированным сорбентом (ТАГА — 80 % выживаемость после экспозиции 6 и 12 часов), что подтверждается результатами исследования смертности животных.

Отмечена положительная тенденция изменения массы селезенки в обеих группах исследуемых препаратов (ТАГА, Ag/ТАГА) при увеличении времени экспозиции сорбентов с микробной флорой, что является доказательством снижения степени выраженности воспалительного процесса. Аналогичные изменения наблюдаются при исследовании массы печени.

Список литературы

1. Энтеросорбция / Н. А. Беляков. — Ленинград : Центр сорбционных технологий, 1991. — 328 с.
2. Сурмашева О. В. Антимiкробнаактивнiсть композиту на основiкаолiну та наночастинок срiбла / О. В. Сурмашева, Л. I. Романенко, Г. I. Корчак // ENVIRONMENT & HEALTH. — 2015. — № 4. — С. 13–17.
3. Благитко Л. И. Применение препаратов серебра в медицине / Л. И. Благитко, А. С. Полякевич, А. И. Бромбин. — Новосибирск : Изд-во ЗАО «Вектор-Бест», 2002. — С. 20–25.
4. Серебро в медицине / Е. М. Благитко [и др.]. — Новосибирск : Изд-во Наука-центр, 2004. — 254 с.
5. Государственная фармакопея РФ XIII изд. Т. 1. ОФС.1.2.4.0002.15 Микробиологическая чистота. — 2015. — [Введ.]. — М., 2015. — С. 852–860.
6. Пат. 2298036 Российская Федерация, МПК C12N5/00. Способы оценки уровня сорбционной активности сорбента / Тихилов Р. М., Афиногенова А. Г., Афиногенов Г. Е. ; патентообладатель ФГУ «Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р. Р. Вредена Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». — № 2004132319 ; заявл. 11.04.04 ; опубл. 27.04.07.
7. Методические указания по бактериологические диагностики смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемых патогенными энтеробактериями № 13-7-2/1759 МСХ РФ. — 1999.